Western Blotting免疫蛋白印迹技术服务（代做wb实验）
WESTERN BLOT是以电泳分离组分，将其从凝胶转移到一种固相支持体，继之以针对特定氨基酸序列的特异性抗体作为探针检测目的蛋白的一种分子生物学技术。
免疫印迹(immunoblotting)又称蛋白质印迹(Western blotting)，它是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。该法是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种新的免疫生化技术。由于免疫印迹具有SDS-PAGE的高分辨力和固相免疫测定的高特异性和敏感性，现已成为蛋白分析的一种常规技术。免疫印迹常用于鉴定某种蛋白，并能对蛋白进行定性和半定量分析。
上海卓康生物科技有限公司为您提供全套免疫印迹(Western blotting)技术服务，全部实验皆使用高质量试剂完成
●主要实验步骤如下：
1. 蛋白质抽提
a.实验对象为组织样品，取适量（250~500mg）新鲜组织样品或正确保存的组织样品，加1ml含蛋白酶抑制剂的总蛋白抽提试剂（或核蛋白抽提试剂），匀浆后抽提总蛋白（或核蛋白）。
b.实验对象为细胞样品，每份样品取1×106～1×107细胞，PBS清洗细胞，去PBS加0.1ml~1ml含蛋白酶抑制剂的总蛋白抽提试剂（或核蛋白抽提试剂）抽提总蛋白（或核蛋白）。
2. 蛋白质定量
按KCTMBCA蛋白质定量试剂盒操作说明操作，测定样品浓度。
3. 变性聚丙烯酰胺不连续凝胶电泳(SDS-PAGE)
将准备好的样品液和生物素标记的蛋白质分子量标准分别上样，标准加进第一个孔中，电泳分离蛋白。
4. 蛋白质转移到硝酸纤维膜或PVDF膜
按Bio-Rad蛋白转移装置说明组装滤纸凝胶纤维素夹层，30mA恒流条件下，4°C转移过夜。
5. 膜的封闭和抗体孵育
a．膜在5％BSA溶液中室温孵育1小时以封闭膜上的非特异结合。
b.封闭过的膜加入一级抗体室温孵育1.5小时，抗原抗体结合。
c.加入HRP标记的二级抗体以结合一级抗体及HRP标记的抗生物素抗体以结合分子量标准，室温孵育膜1小时。加入HRP标记的GAPDH抗体可同时检测GAPDH含量。。
6. 结果检测
化学发光法检测，膜与化学发光底物孵育，经X胶片曝光显影。图片扫描保存为电脑文件，并用ImageJ分析软件将图片上每个特异条带灰度值的数字化。
7. 数据分析
目的蛋白的灰度值除以内参GAPDF的灰度值以校正误差，所得结果代表某样品的目的蛋白相对含量。
8. 提供实验报告
包括详细的实验方法及免疫印迹实验结果的相关图表。。
试剂耗材：
SDS、甘油、Tris、溴酚蓝、丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、TEMED，APS、甘氨酸、甲醇、PVDF膜、Brandford蛋白定量试剂盒、BSA、脱脂奶粉、考麻斯亮蓝、丽春红、氯化钠、氯化钾、DTT、ECL、显影液、定影液等、显影胶片。
仪器设备：
超声仪、核酸蛋白定量仪、Western-blot电泳转膜系统、摇床、曝光合、红灯等。
样本准备：收集106细胞，加入150μl，冰上超声5次，定量。
SDS-PAGE 电泳：
1.准备各溶液。 小烧杯两个，5ml枪头6个，吸水纸，罐胶电泳设备。
2.准备罐胶槽。 将玻璃板擦干净，放入短架子内，薄板靠门，两玻璃板及架子的底缘须在同一平面（否则漏胶）；将湿润的垫片垫于长架子上并铺上密封膜；将短架子装在长架子上（短架子底缘须与垫片紧密接触，否则漏胶）。
3.准备配胶。 将各溶液（ddH2O，单体，Tris-HCl，SDS，TEMED，APS）依次摆好，5ml枪头插于长罐胶槽，调好取TEMED、APS的枪。
4.配分离胶。 在一小烧杯上装半杯ddH2O；另一小烧杯依次加上述各液（加TEMED、APS时要迅速），快速摇匀。
注：胶浓度由需要检测的蛋白大小决定。
5.罐胶。 从玻璃板中间注入胶液，注胶速度均匀，不要产生气泡。罐胶后用ddH2O压胶。
6.等待时： 将Tris-HCl换成pH6.8。换取Tris-HCl及罐胶用的枪头。调好各移液器。
7.30分钟后。 倒掉压胶水，用滤纸吸干残留水，注意不要触及胶面。
8.配集成胶。 参见步骤4。
9.罐胶。 参见步骤5，灌满为止，不要有气泡。
10.插梳。 梳柱下面不要有气泡。
11.等待时。 A：配电泳缓冲液。B：将样本煮沸5分钟。C：水中冷却，短暂离心后依加样序排放好。D：等胶近凝时，将玻璃板装在电泳架子上，罐内槽液于槽中，检查是否密封。E：将上槽架子按于槽中。
12.30分钟后。 罐上槽液超过短玻璃板，拔梳（注意力道适中，不能太快）。放置上样架子。
13.上样30μl。 枪头先伸入至快接近胶面时开始降将上样液缓缓打出，使样品液从胶面往上涨，枪头随液面上涨而上提。可以不把最后一滴样品打出，但是每个样品都须同样处理。
14.加外槽液。
15.电泳。
转膜：
1.准备。 分别准备泡膜和转膜用的试剂和用具，在电泳槽中倒好转膜液
2.揭胶。 电泳结束后，将电泳槽移至水池中，倒掉电泳液，将内槽提起放在水池边，取出两边玻璃板。用纯水冲干净玻璃板，小心揭开短板，去掉集成胶，小心将胶转入转膜液在中。
3.转膜。 将夹子打开，黑色在底，依次放置海绵、滤纸、胶、膜、滤纸、海绵，关好夹子（均在液面下进行，注意气泡）快速放入架子中。在电泳槽中放冰袋。
4.电泳。
封闭及孵抗体：
1.转膜等待时 准备封闭液（即Non-fat milk 5% in TBST）。
2.转膜完毕后， 将膜放入封闭液中，轻摇孵育1小时。
3.孵一抗。 将封闭好的膜在转移到一抗盒子中，室温孵育两小时或4℃过夜，
4.洗涤 将孵育好一抗的膜在TBST洗涤3次，每次5分钟。
5.孵二抗。 将洗好的膜放在二抗中室温孵育两小时。
6.洗涤。 将孵育好二抗的膜在TBST洗涤3次，每次5分钟。
7.ECL化学发光和曝光显影。
客户方需提供：
1、第一抗体( 如Cell signaling technology, Cayman Chemical, Santan Cruz, Zymed等著名抗体公司。)
2、预实验样本
3、正式实验样本
★公司方提供：
1、预实验结果
2、正式实验结果
如客户只需要进行预实验研究，我方可只代理预实验业务并提供结果。
★实验周期与费用：
预实验的费用以欲检测目的蛋白的种类数目（或第一抗体种类数目）计算，公司将在材料和实验经费全部到位的工作日后20个工作日之内提交实验结果。正式实验费用欲检测目的蛋白的种类数目（或第一抗体种类数目）和样本数为单位计算，实验周期为20个工作日，公司将在材料和预付的实验经费全部到位的工作日后20个工作日之内提交实验结果。如客户要求在10个工作日之内完成，每单位样品费用为常规周期的两倍。实验结果以胶片的形式提交给客户
。
收费标准
项目 | 价格 |
总蛋白质提取 | 50 元每个样品 |
WB 实验费 | 每张膜可做1-8个样品 1400元/膜 |
WB 预实验费 | 600元每个指标 |
上海卓康生物科技有限公司
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